CHO细胞灌流培养中稳态的转录组学和蛋白质组学分析

来自瑞士苏黎世联邦理工大学和Merck Biopharma的科学家们在2019年第8期的《Biotechnology & Bioengineering》杂志上发表了题为“Transcriptome and proteome analysis of steady‐state in a perfusion CHO cell culture process”的文章。文中，研究人员指出使用灌流操作可达到长时间的连续蛋白质生产。通过代谢废物的连续去除以及营养物的补充，可在特定的过渡期后，达到稳态（SS）条件，此时，生物反应器内的条件不仅是均一的，而且可随时间保持恒定。这种稳定的状态有益于降低产物异质性。文章通过整体的转录组学和蛋白组学分析，研究了灌流培养对一种产mAb CHO细胞系细胞内生理状态的影响，结果显示，总转录物和蛋白质的99.4%可在第一周达到稳态，即证实，灌流中稳定细胞外条件可形成细胞水平的稳态。本文为原文内容简介，详细内容，请参考原文。

• 使用灌流操作可到达长时间的连续蛋白质生产。

• 通过代谢废物的去除以及营养物的补充，可在特定过渡期后到达稳态条件，此时，生物反应器内的状态不仅均一，而且可随时间保持恒定。

简介

当前生物制药行业工艺发展的主要方向之一是产品质量的控制。对明确的质量模式的需求源于其对药物安全性和有效性的影响。以补料分批模式进行生物生产时，培养过程中细胞环境和条件随时间的变化会影响最终的产品。通过使用灌流模式替代补料分批生产，可以避免或改善这些工艺相关的波动，且有可能可更好地控制质量模式，如N-糖基化。

灌流培养以往被用于连续收获对化学或酶降解敏感的蛋白质，但现在，灌流也被用于工艺强化，包括用于种子生物反应器，以缩短生产生物反应器工艺时间，提高产能利用率，或者用于浓缩补料分批工艺，以达到更高的活细胞密度（VCD），以及结合连续产物收获的长时间灌流生产。Karst等报导，长时间灌流有益于非敏感型G型免疫球蛋白（IgG）的生产，因为生物反应器达到的稳态条件而可获得所需的工艺一致性。

稳态的表征是了解细胞是否达到稳态以及如何达到稳态的关键，可以使用基因组学、转录组学、蛋白组学以及代谢组学等研究，全面了解细胞内状态。Ley等报导，产EPO的CHO细胞系在培养12天后可达到生长和代谢稳态。Zamini等报导在一种CHO灌流工艺中，尽管细胞密度达到100-120x10^6cells/mL，但胞外蛋白质组和代谢组保持稳定，说明高细胞密度灌流适合生物生产。此外，Vernardis等进行了灌流中幼鼠肾（BHK）细胞的代谢图谱分析，结果显示尽管有与细胞衰老相关的时间依赖性代谢漂移，但宏观数据显示在整个培养过程中存在稳态。

为研究商品化细胞系和产物（即CHO和mAb）在稳定VCD条件下的稳态条件，Karst等研究了在相同的连续长时间培养条件下、稳定VCD为40 x10^6cells/mL时76种代谢物的细胞内特性，同时研究了三种不同VCD时的稳态（20、40和60x10^6cells/mL），结果显示，在每种稳定操作条件下都可以达到稳定的细胞内代谢指纹图谱，但不同的稳态有一定的差异。

为了进一步了解达到稳态的过渡转变以及稳态是否彻底达到，需要对灌流工艺以及细胞的生理状态进行充分的定性。为此，科研人员使用一个工业化产mAb的CHO细胞系的稳定长时间培养作为模型工艺，研究了灌流工艺的整体细胞内稳态。

实验方法和结果

生产生物反应器培养

实验平行进行两个产mAb的专利CHO细胞系的相同灌流工艺。简单来说，复苏的细胞在36.5℃、5% CO2条件下扩增1周，然后转移至种子生物反应器，培养使用基础培养基。种子生物反应器以灌流模式（N-1灌流）操作1周，不进行细胞废弃，然后以达到的高细胞密度（40x10^6cells/mL）接种两个生产生物反应器，使用稳定操作以及营养富集培养基，该培养基旨在该特定VCD设定点下，保持较低的细胞特异性灌流速率（CSPR）。反应器工作体积1.5L，连接配有中空纤维组件的交替式切向流（XCell ATF 2）设备。在整个培养时间内，收获液流速恒定，并通过在线生物电容检测，自动调节废弃液流速，以维持细胞密度恒定27天。操作条件设置为pH7.1、400rpm、50%溶氧、通气流速0.22vvm。

分析方法

使用第二代测序和高反应监测（HRM）定量转录组和蛋白质组，从一致性以及达到稳态的过渡，研究获得的折叠变化（FC）时间演变。此外，按到达稳态的过渡时间，对差异表达的转录物和蛋白质进行鉴定和分类，并对其进行功能注释，以将任意上调或下调结果与细胞代谢联系起来。同时，从mAb质量考虑，对N-糖基化半乳糖化过程中起关键作用的两种酶进行研究。此外，为研究在长期培养中mAb产率下降的原因，使用微滴式数字PCR分析了相应的基因拷贝数以及细胞内重、轻链转录以及蛋白质丰度。

灌流工艺的细胞培养数据。A）活细胞密度和活性保持恒定27天；B）生物反应器内葡萄糖、乳酸和氨随时间的变化情况（V.Bertrand，et al., 2019)。

详细实验操作及结果，请参考原文。

结论

在此研究中，科研人员研究了产mAb CHO细胞系的长期培养对基因的细胞内表达以及蛋白质丰度的稳态的影响。整体蛋白质组和转录组分析显示，在最多7天后，可达到细胞内稳态。

根据数据分析显示，转录物和蛋白质有99.4%达到稳态。针对随时间变化的转录物和蛋白质的生物学功能分析显示了细胞生长和代谢条件的适应情况，如过渡期的糖酵解。过渡行为受两个相互叠加的动态因素的影响：i）流体动力学，表征时间约为平均滞留时间的三倍（τR）以及ii）细胞内动态过程，与基因表达以及酶动力学等相关。此外，结果显示B4galt1丰度降低，Glb1丰度增加，这是两个参与半乳糖从N-聚糖去除和添加的特异性转录物，与FAG0和FAG1/2的时间演变相关。这两种转录物达到稳态的过渡时间约为τR后的三到四天，并在总共7天后为转化宏观的稳态。最后，实验观察到的特异性产率的降低与表观遗传效应有关，而不是基因拷贝数的减少，这些效应可通过旨在用于灌流工艺的靶向细胞系的开发来避免。

总结来说，由于调节机制内的稳定条件以及生物反应器内的稳定产物环境，灌流工艺可在培养的第一周获得高度均一的产物质量。

本文部分内容翻译自原文，由于水平有限，如有不当之处，敬请谅解，详细内容，请参考原文。

原文：V.Bertrand, D.J.Karst, A.Bachmann, et al., Transcriptome and proteome analysis of steady‐state in a perfusion CHO cell culture process. Biotechnology & Bioengineering, 2019, 116, 8: 1959-1972.

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